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論文發佈截圖

肺部感染在全球範圍內廣泛流行，具有較高的發病率及死亡率，構成嚴重醫療負擔。早期、準確的病原學診斷對制定針對性的抗生素治療方案、降低病死率具有重要意義。通過檢測BALF樣本，可以較為便捷地診斷各種肺部疾病，包括肺部感染。

在臨床上，BALF樣本中病原體的鑑定主要基於傳統的微生物培養、顯微鏡塗片和聚合酶鏈式反應(PCR)。

傳統的微生物培養，被認為是感染性疾病病原體診斷的金標準，但它存在檢測周期長，靈敏度低，檢測非典型病原體、病毒和苛養微生物具有挑戰性等缺點。鏡檢塗片的檢出率同樣較低，可供選擇的檢測靶標也較少。此外，PCR檢測需要預設針對病原的特異性引物或探針，因此該方法只能檢測已知病原體，在單次檢測中檢測病原體的能力有限。

近年來，二代測序(NGS)技術結合生物信息學已成為人類病原體檢測、鑑定和分析的有力工具，為應對上述臨床診斷挑戰提供了新選擇。

mNGS是一種不依賴培養、無需預設、無偏倚、全面的微生物檢測和分類學鑑定方法，具有高靈敏度、廣泛的病原體範圍以及檢測新出現病原體的能力，已被證明在肺部感染病原體的檢測和鑑定中具有可行性。然而，mNGS仍面臨諸多挑戰，如成本高、人源基因干擾大、結果判讀困難、無法同時進行DNA和RNA雙流程檢測等。

基於靶向擴增技術和高通量測序技術的tNGS應運而生。目前，tNGS似乎具有檢測靈敏度不受人類基因組和背景微生物影響、檢測成本更低、樣本要求更低、工作流程易於標準化、可同時檢測DNA和RNA病原體等優點。然而，基於多重PCR技術的tNGS在BALF樣本中的病原體鑑定性能尚不清楚。

本研究共收集85例疑似感染患者BALF樣本。對每個標本均進行mNGS和tNGS工作流程，分別從樣本維度、病原維度評價並比較mNGS和tNGS在病原體檢測方面的性能。最後，用PCR方法對臨床重點病原體的不一致鑑定結果進行驗證。

mNGS和tNGS的微生物檢測陽性率分別為95.18% (79/83)和92.77%(77/83)，差異無統計學意義(P =0.625)。

mNGS和tNGS病原體檢測結果如圖1所示，主要檢測到細菌和DNA病毒。mNGS共檢測到244種病原菌。細菌共31種，占檢出總數的47.13% (115/244)；DNA病毒有6種，占檢出總數的33.61%(82/244)；真菌15種，佔18.85%(46/244)；寄生蟲檢出1例口腔毛滴蟲，佔0.41%(1/244)。

相比之下，tNGS從83份BALF樣本中鑑定出270種潛在病原體。細菌共28種，占檢出總數的40.00% (108/270)；DNA病毒8種，佔40.74% (110/270)；RNA病毒8種，佔9.26% (25/270)；共檢出真菌8種，佔10.00% (27/270)。

mNGS和tNGS檢測病原體的一致性如圖2所示。76例(91.57%，76/83)樣本mNGS和tNGS檢測均為陽性，3例(3.61%)兩者均為陰性。76例雙陽性樣本中，9例mNGS與tNGS檢測結果完全一致；60份樣本的mNGS和tNGS檢測結果部分一致，至少檢測到1種相同的病原；其餘7例樣本mNGS與tNGS檢測結果完全不一致。

因此，本研究納入樣本的mNGS和tNGS檢測結果完全一致率為14.56%(12/83)，完全不一致率為13.25 %(11/83)，部分一致率為72.27%(60/83)。

圖2：mNGS和tNGS檢測病原體的一致性

圖3比較了mNGS和tNGS檢測每種類型病原、每種病原的陽性樣本數量，並對不同panel範圍和不同報出分類層級的病原進行了特殊標記。RNA病毒和寄生蟲檢出情況的差異是由不同的檢測範圍造成的。

對於細菌，總體陽性率差異無統計學意義。具體而言，兩種工作流程均檢測到的TOP3均為MTBC、流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌，僅胞內分枝桿菌的檢出率差異顯著(P<0.05)，這是由分類學類別不同造成的。對於真菌，兩種方法的TOP3真菌檢出均為煙麴黴、白色念珠菌和耶氏肺孢子菌。病原體陽性率無顯著差異，但由於檢測範圍和分類層級的差異，特定病原體檢測的比例較高，導致mNGS的總體真菌陽性率顯著高於tNGS(P<0.001)。

對於DNA病毒，除細環病毒不在tNGS檢測範圍內外，mNGS和tNGS檢測到的病原譜一致，分別為人EBV、CMV、人皰疹病毒7型、人皰疹病毒6型、人皰疹病毒1型。另外，EBV(P<0.001)、人皰疹病毒7型(P <0.001)、CMV(P<0.05)和人皰疹病毒6型(P<0.01)的陽性樣本數量具有統計學差異，且tNGS總是具有較高的檢出率，這可能反映了mNGS和tNGS之間的性能差異。

圖3：mNGS和tNGS檢測病原體的結果比較

圖4：關鍵病原體mNGS和tNGS檢測結果不一致的PCR分析